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中外研究登上自然封面:這種蛋白讓知更鳥能用地磁導航

(原標題:專訪|中外研究登上自然封面:這種蛋白讓知更鳥能用地磁導航)

澎湃新聞首席記者 賀梨萍

人類的眼睛可以看見可見光波段內的各種顏色,耳朵可以聽見20-20000 Hz頻率範圍內的聲音,但我們至今不知道自身是否有感應地球磁場的感官,這完全是個謎。

公眾將之稱為“第六感”,但科學家並不喜歡這樣的說法,在過去的幾十年裡,他們一直試圖撬開謎團的冰山一角,在鳥類中尋找突破口,它們是如何實現感應地磁場並利用它?歐洲知更鳥(European Robin)是一種極佳的研究對象,這種夜行性遷徙鳥類此前被證明具備地磁導航能力,它們可以利用強度弱到0.5高斯左右的地磁場進行長距離定向,以完成年復一年的季節性遷徙。

然而背後的機制是什麼?對於這個問題,需要一場高度跨學科的配合才能解答一二。北京時間6月23日23時,頂級學術期刊《自然》(Nature)以封面形式在線發表了由德國奧爾登堡大學、英國牛津大學、中國科學院合肥物質科學研究院、美國普渡大學、得克薩斯大學西南醫學中心、德國弗萊堡大學等多個團隊的科學家聯合完成在一項重磅研究,題為“Magnetic sensitivity of cryptochrome 4 from a migratory songbird”。研究證明了鳥類視網膜中的隱花色素蛋白(Cry4)對磁場很敏感,很可能就是長期尋找的磁傳感器。

該研究的通訊作者共有6位,其中一位是來自中國科學院合肥物質科學研究院強磁場科學中心的謝燦研究員,強磁場科學中心為共同通訊單位。謝燦實驗室與奧爾登堡大學團隊一起,首次在實驗室成功製備獲得了具有生物活性的夜間遷徙鳥類歐洲知更鳥的Cry蛋白,為整項研究的成功奠定了基礎。

謝燦在接受澎湃新聞(www.thepaper.cn)記者採訪時表示,這場始於2016年的多方合作僅僅是各實驗室關於生物磁感應研究的第一階段,“這篇文章也是我們長期合作的第一個階段性的成果。”未來仍有大量的工作需要其實驗室和合作方共同探索。

謝燦於2001畢業於中國科學院遺傳與發育生物學研究所,獲理學博士學位。同年8月赴美,在哈佛大學醫學院Timothy Springer實驗室從事分子生物物理學和結構生物學研究。2009年至2019年在北京大學生命科學學院任教授,2019年11月應邀加盟並調入中國科學院強磁場科學中心任研究員至今。2020年12月共同創建“國際磁生物學前沿研究中心”(International Magnetobiology Frontier Research Center (iMFRC))。

值得一提的是,此前的2016年,謝燦實驗室在國際學術期刊《自然-材料》(Nature Materials)發表了其在動物磁感應和生物導航領域的原創性突破,在國際上首次發現了動物對磁場感知的磁受體基因,該基因編碼的磁感應蛋白(MagR)具備內稟磁性,能和Cry蛋白形成複合物,進而識別外界磁場並做出響應。據此,謝燦提出了動物感磁的“生物指南針”假說。該工作被評為“2015年度中國生命科學領域十大進展”。

牛津大學化學系物理與理論化學實驗室的Peter Hore教授也是這項最新研究的通訊作者。Hore是生物磁感應假說主要流派之一,即依賴隱花色素的化學自由基對模型(radical-pair)的主要貢獻者,他在回復澎湃新聞(www.thepaper.cn)記者採訪的郵件中寫道,“如果我們能證明Cry4是磁感受分子,我們也就證明一個根本性的量子機制,它使得動物能感知極其微弱的環境刺激,這個刺激的強度比以前認為的要弱一百萬倍”。

提及上述化學自由基對假說,時間要撥回到1978年。彼時,德國化學家Klaus Schulten等人提出初步模型,將量子糾纏引入這一研究領域,認為鳥類的磁感應機制涉及自由基對的糾纏態。Schulten團隊最終於2000年發表了研究成果, 指出隱花色素很可能就是鳥類磁導航過程中的關鍵分子, 並大膽推測了感磁過程。

其後經過近20年的發展,該假說的輪廓日漸清晰:首先是隱花色素中的光敏色素輔基FAD吸收一個藍光光子的能量, 並由此引起FAD基團电子的躍遷, 留下一個空軌道; 然後從臨近的四個色氨酸上依次奪取电子,這就是“电子轉移”,此時這對被分離的电子由於量子糾纏同時具有自旋單態和三重態; 最後, 兩種狀態的微妙平衡可由地磁場的方向決定, 並通過某種方式將此信息傳遞給大腦, 使生物體可以對地磁信息作出響應。

研究團隊從物理學、化學和生物學等多方面系統且完整地總結了自由基對假說的基本原理和支撐證據。

相比於此前的理論研究,此次這項多方合作的研究以歐洲知更鳥的隱花色素4蛋白為主要研究對象,開展了一系列高精度的光譜學測試,並進行計算生物學模擬,實現了理論和實驗的相互驗證。這是首次對夜行性候鳥隱花色素蛋白中自由基光化學磁敏特性的全面闡釋,證實並完善了自由基對磁感應機制,對深入解釋候鳥地磁定向行為提供了重要依據。

來自遷徙鳥類的功能性Cry4蛋白

早在2000年,科學家通過理論計算,提出光敏蛋白隱花色素(Cry)是一種可能的磁感應蛋白。理論上,在藍光條件下,外部磁場信息可以轉化為隱花色素蛋白中的光致自由基對量子產率變化,從而被細胞感知。

隱花色素蛋白為何被科學家認為是動物磁感應分子?該論文的第一作者、來自奧爾登堡大學的許靜靜對澎湃新聞(www.thepaper.cn)記者解釋道,隱花色素蛋白能夠結合黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD),又名活性型維生素B2,FAD受藍光激發后發生還原反應,可依次奪取其附近色氨酸(Trp)的电子,從而形成具有磁敏性的自由基對[FAD·-  TrpH·+]。

“可以說,FAD是這個磁敏分子的‘心臟’,只有結合了輔因子FAD的隱花色素蛋白,才具備磁敏性的先決條件。”許靜靜現為奧爾登堡大學Henrik Mouritsen實驗室的博士生,在赴德國留學之前,許靜靜在中國科學院電工研究所完成了碩士學習,並在謝燦教授實驗室接受了生物化學技術訓練。。

值得一提的是,自由基對磁感應假說自1978年提出后遲遲未能在鳥類中被實驗證實的原因之一,即重組表達的鳥類隱花色素蛋白往往因為蛋白質的錯誤摺疊而失去其本身的功能,對隱花色素來說就是喪失了關鍵輔基FAD。

“自由基對假說此前的最大的遺憾是,科學家從未能在遷徙鳥類中獲得隱花色素蛋白的磁敏感性的實驗證據。早期的嘗試中曾經有實驗室用植物或者非遷徙動物的隱花色素蛋白做過一些實驗,但作為最典型的遷徙動物,候鳥,受限於鳥類隱花色素蛋白的純化難度,從來沒有真正被研究過。”謝燦補充道。

在這項研究中,科學家們終於獲得了有功能的、結合FAD的遷徙鳥類隱花色素蛋白。在謝燦和Mouritsen的指導下,許靜靜利用實驗室定製優化后的Cold-Shock蛋白表達系統,表達並純化了具有生物活性的夜間遷徙鳥類Cry4蛋白。該蛋白質樣品因FAD發色團的存在而呈現出美麗透明的黃綠色,質譜分析显示該蛋白的FAD結合率高達97%。為整項研究的成功奠定了基礎。

歐洲知更鳥Cry4蛋白的獲得實際上頗為曲折。謝燦對澎湃新聞記者表示,早在合作之初,也就是2016年4月,原計劃是由謝燦實驗室在國內製備蛋白,然後通過航空運輸送往國外的合作團隊進行下一步測試試驗。

在此前關於MagR的研究中,謝燦已成功表達純化了信鴿(能定向歸巢,但非季節性遷徙鳥類)的MagR和Cry蛋白,以及兩種蛋白的複合物。

但國際運輸方案並不可行。謝燦清晰地記得,2016年的6月9日,其實驗室第一次往英國牛津大學寄送樣品進行實驗,但舉步維艱。“長途國際運輸蛋白質樣品需要將蛋白首先冷凍保存,然後到達目的地的實驗室之後再解凍。當時發現一個問題,無論是Cry蛋白,還有我們自己發現的MagR蛋白,或者是兩者的複合物,所有這些跟磁感應相關的蛋白都非常的不穩定,而且對溫度極度敏感,在凍融的過程中蛋白質的活性大大降低乃至消失。”對於此次研究中Cry4蛋白來說,經歷了長途運輸和凍融過程后,關鍵的FAD輔基從Cry4蛋白中解離出來,Cry4蛋白也喪失了活性。

在當時的情況下,Cry蛋白質如何“保鮮”是亟待解決的問題。恰好此時,許靜靜在申請Mouritsen實驗室的訪問學者。2016年11月,Mouritsen提出一個建議,讓許靜靜直接進入謝燦實驗室,學習整套蛋白表達純化的技術。在合作的框架下,謝燦是非常開放的,“這樣對我們來說也是一個好事情,因為本身我們發表的文章也希望別人能夠重複。”2個多月的高強度“速成班”后,許靜靜進入Mouritsen實驗室。

“花了大概七八個月的時間,許靜靜在Mouritsen實驗室把整個系統從零開始地建立了起來,Cry4蛋白的表達純化完美地重複出來,而且也有很好的活性。”關鍵的基石工作完成后,Hore和Mouritsen難掩激動,在發給謝燦的郵件中表達着他們的興奮,也就是那一刻,三方正式確立了長期合作。“我們三個是完全不一樣的背景,Hore是物理學家,所以他主要是做物理化學這一塊,Mouritsen是做動物行為學和神經生物學的,我是做蛋白質研究的,所以我們三個人各有所長,正好可以互補配合。”謝燦是這樣描述這一三方合作的。

在隨後的2年多時間里,許靜靜一般會在上午完成蛋白製備,然後坐上從德國飛往英國的航班,下午抵達牛津大學后直奔實驗室,和團隊的成員一起測試蛋白的性能,即自由基對光化學反應的磁敏特性。謝燦有一次在訪問牛津大學時“體驗了半趟”,“我能夠意識到那2年多時間里她基本上都是這麼穿梭在兩個國家的多個實驗室中,實驗就是這麼做過來的。”謝燦表示。

首次用遷徙鳥類隱花色素蛋白實驗驗證自由基對假說

在這項研究的開展過程中,鑒於實驗內容的複雜性,涉及到的測試也極度複雜,更多的實驗室加入了進來。論文中即提到,為了研究磁場對隱花色素光化學的影響,研究團隊開發並不斷完善了多種光譜技術。

牛津大學的研究團隊開發了一系列專門用來研究隱花色素光化學磁場效應的光譜學技術,包括瞬態吸收光譜測試(Transient absorption spectroscopies),共振腔環路衰減光譜測試(Cavity ring-down spectroscopy),寬帶腔增強吸收光譜測試(broadband cavity-enhanced absorption spectroscopy)以及电子順磁共振(electron paramagnetic resonance)。Hore如此形容,“這些設備,是實驗室一代又一代有才華的博士后和研究生共同努力多年以來才開發出來的。”

許靜靜介紹道,簡單來說,研究人員將蛋白樣品放置於磁場中,並用450nm藍光照射,檢測不同磁場條件下以及不同時間分辨率下,該蛋白瞬態自由基對的光吸收變化。

實驗結果显示,施加磁場后,隱花色素蛋白中的自由基對產量發生了變化,即磁場效應(magnetic field effect),並且歐洲知更鳥的隱花色素蛋白比非候鳥(雞和鴿子)的隱花色素蛋白磁場效應強10到20倍。

研究團隊還闡明了這種磁敏感性產生的機理,即基於藍光吸收引發的电子轉移反應。蛋白質分子由一連串氨基酸組成: Cry4有527個氨基酸,其中的4個色氨酸對於磁敏特性至關重要。在藍光的激發下,电子在FAD和這4個色氨酸跳躍,產生所謂的磁感應自由基對。牛津大學的Peter Hore和奧爾登堡的物理學家Ilia Solov’yov進行了量子力學計算,支持這一觀點。

為了驗證這一點,奧爾登堡大學的研究人員又進一步製備了隱花色素的色氨酸突變體蛋白,即电子傳遞鏈上的4個色氨酸(WA、WB、WC和WD)依次由苯丙氨酸(F)替代,後者無氧化還原活性,不能給FAD提供电子,從而切斷电子傳遞鏈。

在各突變體蛋白中,电子傳遞鏈依次被為3個、2個和1個色氨酸,瞬態吸收光譜測試結果显示,突變體蛋白的自由基對壽命由微秒縮短為納秒、皮秒級別。电子順磁共振測試結果显示,野生型蛋白的自由基[FAD·+ TrpDH·+]相距2.2nm, 第4個色氨酸被突變以後,自由基對[FAD·+ TrpcH·+]相距1.8nm。

論文指出,該實驗結果與理論模擬吻合。在野生型隱花色素蛋白中,电子依次在4個色氨酸間轉移,這4步轉移使得最終未配備电子相距最遠,從而形成了長壽命的自由基對,後者自旋相干的超精細作用是磁場作用點。

許靜靜提到,令人驚訝的是,當最遠端第4個色氨酸被突變之後,蛋白質的磁場效應反而比野生型蛋白更強,並且比同是三色氨酸电子傳遞鏈的擬南芥植物隱花色素的磁場效應強。

研究人員提出,為什麼大自然要為鳥類隱花色素蛋白進化出第4個色氨酸,如果它的作用僅僅是降低磁場靈敏性?進一步研究显示,野生型蛋白(ErCry4)和突變體(ErCry4 WDF)在毫秒時間內的衰變動力學反應相似,並且磁場二分值(B1/2)相近。這意味着二者的磁敏性起源一致,均來自第3個色氨酸,第4個色氨酸可能並未參与動物磁感應過程。

那麼這第4個色氨酸介導的电子傳遞究竟發揮什麼作用呢?Ilia Solov’yov課題組與Hore課題組通過自旋動力模擬,並基於上述實驗結果,提出了自由對動態平衡機制,即电子在第3和第4色氨酸之間可能來回跳躍,由此形成的兩個自由基對[FAD·- TrpCH·+]和[FAD·+ TrpDH·+]處於快速動態平衡中,並分別扮演不同的角色。

兩種角色分別為:由黃素-第三色氨酸形成的自由基對主要負責磁場感知,由黃素-第四色氨酸形成的自由基對主要負責體內生化信號傳導。“這一機制在以前任何物種的隱花色素蛋白中都未發現過。”謝燦表示。

研究團隊預測,也許在體內還存在與隱花色素蛋白互作的其他蛋白,如謝燦此前報道過的MagR或者其他尚未鑒定的信號分子,實現信號的級聯放大或者對隱花色素蛋白的定向排列,進一步增強在生物體內的磁敏感性和對方向的識別。“當然這些推測都需要未來更多的實驗去證實。”

他們猜測,或許,大自然正是通過這種精巧機制,絕妙地優化了隱花色素蛋白的自由基光化學反應,實現了磁場感受並信號傳導的雙重功能,從而使得遷徙鳥類在跨越半球的旅程中找到方向。

謝燦向澎湃新聞記者總結道,這項研究主要取得的突破為,第一,從實驗上用遷徙鳥類的隱花色素蛋白驗證了自由基對假說;第二、發現遷徙鳥類的隱花色素蛋白4比非遷徙鳥類的對磁場更敏感;第三、首次發現自由基對假說中的四個保守色氨酸分別承擔著磁感應和信號傳遞兩種不同功能。

爭議中前行,體內驗證並非易事

值得注意的是,在動物磁感應研究領域,目前尚存在諸多爭議。

謝燦表示,綜合來看, 截至目前備受關注的磁感應假說主要有電磁誘導模型、磁鐵礦顆粒模型、依賴隱花色素的化學自由基對模型、生物指南針模型。這些假說均有一定的實驗證據支持, 同時也存在一定的局限或不足。

謝燦將動物磁感應研究稱之為“很不生物學”的一項研究。類比感官生物學常規的研究思路,科學家們首先已經確定地知道某種特定感覺系統的存在, 以及是何種感覺器官, 在此基礎上鑒定出該感覺系統的感受器細胞、神經通路以及大腦中與該感覺相關的區域等。

但磁感應研究截然不同。在這一領域,往往由生物學家們發現和提出了問題,但由物理學家們提出了天馬行空的假說,然後化學家們也會參与進來開展大量的驗證試驗。此前謝燦實驗室關於MagR的發現與生物指南針假說的提出也大體上遵循了這一思維範式。

儘管這項最新的研究取得了多項重要突破,但Hore強調,這並不是隱花色素就是磁傳感器的確鑿證據。因為“這項研究是用純化的蛋白做的體外實驗,實驗中用到的磁場也遠高於地磁場。” Henrik Mouritsen表示 “我們需要在鳥類的眼睛中證明這一蛋白對地磁場的敏感性,但目前的技術瓶頸並不能讓我們做到這一點。”

研究團隊推測,隱花色素蛋白在體內環境中可能會表現出對磁場更高的敏感性。例如,在視網膜細胞中,蛋白質可能有固定的取向而排列起來,從而增強了它們對磁場方向的敏感性。此外,它們還可能與其他蛋白相互作用,例如此前報道的磁受體MagR,甚至其他尚未被鑒定的蛋白質,以實現信號級聯放大的效果。科學家們也正在尋找這些未知的“互助夥伴”。

關於該項目的未來研究計劃,許靜靜指出,尋找隱花色素的互作蛋白和並進行體內實驗驗證,是兩大挑戰。

實際上,截至目前,即使自由基對假說的證據最為全面,但動物磁感應機制研究的多個假說均需不斷髮展、完善和甄別。“磁感應領域流派眾多,每一個研究成果的發表,在審稿過程中都需要經受審稿人的廣泛質疑和挑戰,而這些審稿人常常都來自不同的學術流派,帶着不同的學術觀點,而且,常常還是你的競爭對手。只有說服你的競爭對手,才有可能最終通過審稿而發表。”這篇論文長達近2年的審稿也彰顯了過程的曲折。

謝燦更願意將科學界的這種爭議稱為學術辯論。“學術上的廣泛爭議和辯論,這本身就說明你研究的問題是非常重要的,這是顯而易見的道理。”其次,謝燦認為,伴隨着學術爭議和辯論的進行,往往帶來的是整個領域的飛速發展,“因為會有更多的,更嚴謹的實驗被設計出來,去驗證各自的觀點。無論是證明還是證偽,我們越來越逼近科學的真相”

謝燦認為,動物磁感應領域之所以充滿爭議,“就是因為到目前為止沒有任何一個假說或者模型是被所有人都公認的,每一個流派都有自己的支持者。”

類似此次的強強合作或能帶來加速推進。“這是一個學科高度交叉融合的領域,如果想要在動物磁感應和生物導航領域做一些有趣的課題,很多時候都不可能依賴於一個實驗室來完成。”謝燦表示。

許靜靜也同樣提到,“解決一個科學問題,需要來自多個學科的共同努力,在我們團隊中,各學科領域的專家擁有世界一流的技術,這對於促成了我們的研究至關重要。”她表示,在項目推進過程中,研究人員持續不斷地溝通交流,理解不同學科領域的知識,以實現共同的科學目標。

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